再生机器人是一个活跃的新兴领域，旨在开发可以通过利用身体的生物物理传感能力来促进组织愈合的技术。基于机器人的非侵入性机械负荷（ML）疗法（也称为“机械疗法”）的开发已被探索，特别是用于骨骼肌修复，因为其对机械线索的敏感性众所周知。肌肉干细胞对ML的反应表现出强烈的激活和增殖行为，并机械疗法已被证明通过增强肌肉功能，改善受损肌纤维的结构修复以及减少组织纤维化来实现损伤后治疗。然而，迄今为止关于这些疗法及其机制的大部分数据都来自对年轻动物的研究。鉴于随着年龄的增长和老年人口的不断增长而发生的许多生理变化，更好地了解再生机器人疗法如何发挥其生物效应以及这些效应如何随着身体年龄的增长而变化对于为不同年龄组的临床研究提供信息至关重要。

近日，哈佛大学约翰·A·保尔森工程与应用科学学院的David. J. Mooney院士率领其团队在Science Robotics上发表了一项关于机器人驱动的机械负荷（ML）疗法在老化骨骼肌再生中的研究工作。基于先前关于ML在年轻肌肉再生中的免疫调节作用的研究，假设ML将通过下调慢性衰老炎症反应来促进衰老肌肉修复，同时刺激老年干细胞群。在对ML的反应下，在受伤的老年肌肉中发现炎症显著加重，以及老年肌肉干细胞再生行为的受阻。虽然机器人驱动的ML本身阻碍了老化的肌肉再生，但将ML与糖皮质激素（GC）疗法相结合，对抗ML引发的炎症副作用可以逆转这些负面影响，并使严重损伤后的衰老肌肉再生成为可能。

老化肌肉在严重受伤后表现出愈合受损和免疫反应改变：

首先研究年轻（2至3个月大）和老年（20至22个月大）动物严重受伤肌肉恢复的差异。受伤后14天，受伤年轻肌肉的收缩力与未受伤组无显著性差异。但是到第21天，受伤老化肌肉也不能产生大于未受伤组35%的收缩力。此外，在连续刺激后，与年轻肌肉相比老化肌肉的抗疲劳性显着降低。老化肌肉表现出比年轻肌肉更高的受损肌纤维百分比和纤维化、更严重的钙化和脂肪沉积。未受伤老年和年轻肌肉中的总肌肉干细胞相似，但在受伤后3天观察到年轻肌肉中肌肉干细胞明显增殖。

由于肌肉损伤炎症反应是决定再生的关键因素。受伤年轻肌肉中的总免疫细胞在第3天达到峰值，随后下降到基线。然而，在老化肌肉中第3天的免疫细胞数量显着降低，并且在第7天达到较晚的峰值。中性粒细胞是炎症级联反应中最早的反应者，在第1天观察到年轻肌肉中数量明显高于老化肌肉。巨噬细胞和树突状细胞是肌肉干细胞行为的关键调节因子，第3天年轻肌肉中达到顶峰。然而在老化的肌肉中，这些细胞峰值发生在第7天和第10天之间，随后是炎症消退的延迟，细胞数恢复到未受伤基线值的速度较慢。这些发现证实了老年肌肉严重损伤后的恢复受损与炎症消退延迟。

图 老化骨骼肌在受伤后表现出愈合受损和炎症消退障碍

机器人驱动的ML仅促进严重受伤后年轻肌肉恢复：

使用具有柔软弹性界面的机器人负荷装置对受伤后肢施加循环压力。年轻和老年肌肉在严重受伤后1天开始接受每日ML治疗。在年轻小鼠中，ML治疗14天后显着提高了受损肌肉的收缩力和速度。这些对肌肉功能的正面疗效并没有随着年龄的增长而保留。治疗21天后，ML治疗在老年小鼠的肌肉功能方面没有作用，肌肉收缩力和速度仍然明显低于受伤年轻肌肉。

组织学分析显示，ML显著降低了受损年轻肌肉中肌纤维受损的百分比和组织纤维化程度。损伤治疗14天后，受伤老化肌肉的纤维化程度显著高于同期受伤年轻肌肉。这种严重损伤后的肌肉再生也可能在一定程度上受到周围神经和神经肌肉突触的影响，在年龄背景下就显得更加重要。恢复14天后，年轻和老年肌肉的突触密度没有观察到显着的年龄依赖性。然而，ML治疗仅促进受伤年轻肌肉的平均突触密度增加，而不是老化肌肉，这表明该损伤模型中神经元突触形成的潜在机械敏感性可能随着年龄的增长而失去。这些发现揭示了ML对严重损伤后肌肉再生的重要年龄依赖性影响。

图 ML治疗不能对受伤老化肌肉产生治疗效果

ML在恢复过程中破坏衰老肌肉干细胞的再生行为：

由于肌肉干细胞的活化、增殖和分化对于肌肉再生的发生至关重要，接下来评估损伤后对ML响应的衰老干细胞行为。ML治疗老化肌肉在第7天出现肌肉干细胞峰值，直到第14天仍然显着高于对照组，而对照组已经趋向基线水平。由于损伤后观察到的大多数Pax7细胞是肌生成的MPC，量化表达MyoD的Pax7细胞比例。Pax7/MyoD双阳性细胞也在损伤后3天达到峰值，与ML处理组相比对照组中的Pax7+/MyoD+细胞在第3天的比例显着更高，随后下降得更快。已知成肌细胞转化为肌细胞伴随着肌生成蛋白（MyoG）的表达，量化表达MyoG的细胞数量。第14天，ML治疗肌肉中Pax7+/MyoG+细胞数量减少了3.8倍。这些数据表明，在接受ML治疗的受伤老年肌肉中，Pax7+ MPC转化为终末分化的MyoG肌细胞存在延迟。

接下来分析肌肉纤维的成熟度。一旦新再生的肌纤维形成，它们就开始重新表达肌球蛋白重链（eMHC）。对照组中表达eMHC肌纤维的百分比在第3达到峰值，而ML治疗组在第7天观察到的较晚峰值。到第14天，ML治疗组仍然表现出大量活跃再生的eMHC肌纤维。与ML治疗的肌肉相比，对照组表现出明显更多的较大成熟纤维。此外，与对照组相比，发现ML治疗的肌肉中指示再生肌纤维的中央有核纤维百分比降低。这些数据表明，与接受ML治疗的肌肉相比，未经治疗的受伤老年对照肌肉似乎正在经历更有效的再生过程。

图 ML破坏老年骨骼肌中MPC的再生行为

严重损伤后，ML对老化和年轻肌肉炎症的差异调节：

前文验证了ML治疗受伤年轻肌肉导致损伤后3天组织中性粒细胞显着减少。相比之下，受伤老化肌肉在14天的ML治疗中没有表现出组织中性粒细胞数量或动力学的任何变化。此外，总老年免疫细胞、老年巨噬细胞或衰老树突状细胞的细胞数量或动力学也没有变化。巨噬细胞亚型（M1、M2a和M2c）同样不受受损老年肌肉ML治疗的影响。

接下来检查广泛细胞因子和趋化因子的表达。在受伤年轻肌肉中，在14天的ML治疗中促进了许多促炎标志物的下调。然而，在受伤老年肌肉中观察到相反的趋势，其中ML产生促使大多数细胞因子的增加。对年轻与老年肌肉中显着改变因素的基因富集分析显示，年轻肌肉中显着减少的标志物主要参与通过 CCR 和 CXCR 结合或细胞因子产生等机制驱动炎症级联反应，以及介导免疫细胞趋化性。而在老化的肌肉中，这个进程是截然相反的。与受伤未治疗对照相比，接受ML治疗的受伤老年肌肉中干扰素-γ，肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的mRNA和蛋白质水平增加。总的来说，这些数据表明，ML通过对肌肉内免疫细胞存在的差异效应和对损伤后促炎细胞因子级联的相反作用对免疫系统产生年龄依赖性影响。

图 ML治疗免疫调节基于年龄依赖性

GC与ML联合治疗可改善老化肌肉的再生结果：

为了验证ML诱导老化肌肉炎症干扰再生的假设，将每日GC给药与ML相结合，通过减少损伤组织中几种炎症标志物的表达来减轻ML诱导的老年肌肉炎症。对用ML治疗的受伤老年肌肉中上调至少50%的标记物进行基因富集分析，揭示了参与免疫细胞趋化性、促炎细胞因子产生和趋化因子活性的关键途径出现了下调。将ML与GC结合治疗受伤老年肌肉降低了促炎标志物IFN-γ和TNFɑ的mRNA和蛋白质表达水平。与对照肌肉相比，仅ML治疗组的NF-κB和TNFRSF1b表达均升高，而ML+GC治疗组组的表达显着降低。在ML+GC治疗14天后，参与血管生成信号传导的标志物显着减少，这可能部分是由自我调节反馈驱动的。ML+GC治疗组在14天内后肢灌注表现出显着改善，并且在第7天后肢坏死显着减少。这些数据表明GC疗法可以逆转ML治疗对损伤后老年肌肉炎症的负面影响，特别是通过调控细胞因子相关路径来防止ML诱导的几种关键促炎标志物的上调。

图 GC治疗可改善ML诱导的老化肌肉炎症

进一步评估衰老肌肉干细胞对ML+GC联合治疗的反应。第14天与仅使用ML组相比，ML+GC组的Pax7+ MPC水平显着降低，Pax7+/ MyoD+细胞数量显着降低。此外，ML+GC组中eMHC的肌纤维百分比也降低。在ML+GC组中出现更大，更成熟的肌纤维的同时，观察到主动分化肌源性前体的减少和未成熟eMHC肌纤维数量的减少。用ML+GC治疗老年肌肉的炎症减少，灌注增加，坏死减少和肌源分化改善促使进一步评估在GC介导炎症控制下ML是否可以改善严重损伤后的衰老肌肉功能。治疗7天后，观察到ML+GC组受伤老化肌肉的收缩力与对照组和ML治疗组相比均有显着改善。到第14天，ML+GC组表现出比所有组更高的平均收缩力和速度。这些发现指出了老年炎症反应在受伤后老年骨骼肌再生中的抑制作用，以及使用炎症控制减轻ML对老年肌肉再生的负面影响的潜在应用。

图 GC介导的炎症控制下ML治疗改善老化肌肉的再生结果

小结：

作者团队发现了受伤骨骼肌对机器人驱动ML响应的年龄依赖性差异，并确定通过非侵入性机械疗法再生老年骨骼肌的潜在免疫治疗途径。尽管再生机器人策略在肌肉修复方面具有令人兴奋的前景，但这里揭示了衰老干细胞和免疫细胞对ML响应的显着差异，这为基于机器人的机械疗法实现最好地转化提供了见解。与先前在年轻肌肉中的发现相反，ML治疗对衰老肌肉的再生没有益处，反而会加剧组织炎症并扰乱衰老肌肉干细胞的功能。然而，使用GC治疗减少炎症减轻了ML对老年干细胞的负面影响，并使老年肌肉对机械疗法做出反应，从而突出了生物学因素（如年龄）在机械疗法中的重要性。尽管GC治疗可能伴有一系列潜在的不良反应，但在这项工作中使用GC仅在于提供了概念证明。进一步的研究应侧重于使用更有针对性的辅助药物与ML联合使用，以及对ML在衰老肌肉中的负面影响进行更深入的评估。老年创伤是一个可以从机器人辅助组织再生技术中受益匪浅的医学领域。这项工作证明了使用药物控制与年龄相关的生物变化作为基于机器人治疗辅助手段的重要性。

中国机器人峰会转载